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Sep 10, 2023

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Parasites et vecteurs

Parasites & Vecteurs volume 16, Numéro d'article : 186 (2023) Citer cet article

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Le virus de la rivière Ross (RRV) est l'arbovirus transmis par les moustiques le plus répandu et le plus répandu en Australie et constitue un problème de santé publique important. Avec l'augmentation des impacts anthropiques sur la faune et les populations de moustiques, il est important que nous comprenions comment le RRV circule dans ses points chauds endémiques pour déterminer où les efforts de santé publique doivent être dirigés. Les méthodes de surveillance actuelles sont efficaces pour localiser le virus mais ne fournissent pas de données sur la circulation du virus et de ses souches dans l'environnement. Cette étude a examiné la capacité d'identifier les polymorphismes mononucléotidiques (SNP) dans la région variable E2/E3 en générant des haplotypes pleine longueur à partir d'une gamme d'échantillons dérivés de pièges à moustiques.

Un nouveau flux de travail d'amplification d'amorces en mosaïque pour amplifier RRV a été développé avec une analyse à l'aide de MinION d'Oxford Nanopore Technology et d'un protocole bioinformatique ARTIC/InterARTIC personnalisé. En créant une gamme d'amplicons sur l'ensemble du génome, une analyse SNP à grande échelle a été rendue possible en ciblant spécifiquement la région variable qui a été amplifiée en tant que fragment unique et en établissant des haplotypes qui ont informé la variation spatio-temporelle du RRV dans le site d'étude à Victoria.

Un pipeline bioinformatique et de laboratoire a été conçu et mis en œuvre avec succès sur des homogénats de pièges entiers de moustiques. Les données résultantes ont montré que le génotypage pouvait être effectué en temps réel et que tout le consensus du piège des virus (avec les principaux SNP) pouvait être déterminé en temps opportun. Des variantes mineures ont été détectées avec succès dans la région variable E2/E3 du RRV, ce qui a permis la détermination de l'haplotype dans des échantillons complexes d'homogénat de moustiques.

Les nouvelles méthodes bioinformatiques et de laboratoire humide développées ici permettront une détection et une caractérisation rapides des isolats de RRV. Les concepts présentés dans cet ensemble de travaux sont transférables à d'autres virus qui existent en tant que quasi-espèces dans des échantillons. La capacité à détecter des SNP mineurs, et donc des souches haplotypes, est d'une importance cruciale pour comprendre l'épidémiologie des virus dans leur environnement naturel.

Le virus de la rivière Ross (RRV) (genre Alphavirus, famille Togaviridae) est un arbovirus transmis par les moustiques, endémique à l'Australie et également détecté en Papouasie-Nouvelle-Guinée et dans les îles du Pacifique Sud [1]. Le RRV peut causer de la polyarthrite chez l'homme, une forme d'arthrite débilitante qui a le potentiel de causer des problèmes de santé à long terme [1]. Le RRV présente également des symptômes tels que fièvre, éruption cutanée et fatigue chez l'homme [1]. Des signes cliniques chez les chevaux ont également été rapportés [2] et ils ont été incriminés comme amplificateurs du virus [3]. Les principaux moustiques vecteurs du virus en Australie sont Aedes camptorhynchus, Ae. vigilax, Culex annulirostris [4] et Ae. notoscriptus [5]. Les macropodes ont été attribués comme principal hôte réservoir, mais d'autres mammifères et oiseaux placentaires pourraient également agir comme réservoirs [6]. Le transfert du virus se fait par la piqûre d'un moustique femelle et, occasionnellement, un moustique femelle infecté peut transmettre verticalement le virus à ses œufs, ce que l'on appelle la transmission transovarienne [7,8,9]. L'expansion de la population humaine dans les habitats des moustiques augmente les interactions homme-moustique [10,11,12] et augmente le risque pour l'homme d'être affecté par les arbovirus (y compris le RRV) [13]. Cette tendance mondiale devrait augmenter [14, 15], et la surveillance des virus transmis par les moustiques est donc impérative pour soutenir la santé publique.

Le RRV a été détecté pour la première fois en 1958, près de Townsville, dans l'extrême nord du Queensland, en Australie, le plus ancien isolat (T48) étant classé G1 [16]. Il existe quatre principaux génotypes de RRV, G3 et G4 étant des descendants directs de G1, et G2 son propre groupe distinct [17, 18]. Chacun de ces génotypes occupe actuellement ou a historiquement occupé des régions spécifiques de l'Australie. G1 et G2, bien qu'apparemment ne circulaient plus, étaient couramment trouvés dans le Queensland et l'Australie occidentale dans les années pré-2000 [19]. G3, un autre génotype historique, était principalement localisé aux Îles Cook à la fin des années 1970 et au début des années 1980 [19]. Certaines séquences G3 ont été observées dans divers États australiens au début des années 2000, la détection la plus récente étant un isolat de 2014 de Tasmanie. Ces trois génotypes ont été pour la plupart remplacés par le génotype le plus courant actuellement en circulation, G4. La souche G4 de RRV est divisée en sous-lignées, déterminées par des analyses de similarité des nucléotides [19]. Les sous-lignées G4, nommées G4A, G4B, G4C et G4D, ont été signalées en Australie-Occidentale, à Victoria, au Queensland, en Nouvelle-Galles du Sud, en Papouasie-Nouvelle-Guinée et dans le Territoire du Nord, les isolats les plus récents (2018) étant attribués aux G4B et G4A. sous-lignées [19].

Les virus à ARN, tels que le RRV, mutent rapidement en raison de l'absence de mécanisme de relecture de l'exonucléase 3' de leur ARN polymérase dépendante de l'ARN [20,21,22]. L'activité exonucléase de l'enzyme polymérase joue un rôle important dans la réplication de l'acide nucléique, de sorte que lors de la reconnaissance d'une base incorrectement incorporée, la direction de la polymérase est inversée et la base incorrecte est éliminée. Les virus à ARN manquent de cette activité et, par conséquent, toutes les bases incorrectement incorporées resteront dans la séquence d'acide nucléique, ce qui entraînera un taux plus élevé de mutations dans les virus à ARN par rapport à d'autres organismes, bien que certaines mutations entraîneront des mutations délétères [23, 24]. Des régions très variables, y compris les séquences nucléotidiques qui codent pour les glycoprotéines d'enveloppe et interagissent avec les récepteurs de la cellule hôte, sont souvent utilisées pour caractériser les variants viraux, y compris le RRV [19, 25, 26]. Dans le RRV, une région couramment utilisée pour éclairer les études épidémiologiques moléculaires est la région E2/E3 codant pour les glycoprotéines des récepteurs de surface [19, 27, 28]. Des niveaux plus élevés de mutation sont souvent observés dans les glycoprotéines virales, avec des changements d'acides aminés dans ces régions liés à des augmentations des taux de transmission parmi les arbovirus tels que le chikungunya et le virus du Nil occidental [29].

Le séquençage du génome entier (WGS) permet d'évaluer la variation intra-échantillon d'un génome cible dans des échantillons environnementaux complexes, tels que des pièges à moustiques entiers. Le flux de travail RAMPART du réseau ARTIC [30] est un pipeline basé sur WGS qui a été utilisé dans des études d'épidémiologie moléculaire de l'épidémie de virus Ebola de 2014 à 2016 en Afrique de l'Ouest [31] et a ensuite été utilisé pour la pandémie de virus Zika en Afrique de l'Ouest. Amérique du Sud [30], poliovirus [32] et SARS-CoV-2 [33]. Le réseau ARTIC utilise une approche ciblée qui utilise l'amplification PCR en mosaïque et RAMPART pour la cartographie de référence en temps réel afin d'identifier le virus présent dans l'échantillon [30, 34]. RAMPART est un système d'analyse de bout en bout qui intègre des programmes couramment utilisés (minimap2 [35] et Porecho [36]) dans une interface graphique conviviale, permettant à l'utilisateur de surveiller les séquences de séquençage Oxford Nanopore MinION en temps réel. Les lectures annotées de RAMPART peuvent ensuite être traitées en aval. Actuellement, la post-analyse de RAMPART peut être exécutée à l'aide de l'interface graphique InterARTIC [37]. Ce pipeline combine BCFtools [38], medaka [39], nanopolish [40] et minimap2 [35] entre autres programmes pour générer des SNP appelés génomes viraux à partir des données Nanopore.

Dans cette étude, nous avons personnalisé les flux de travail InterARTIC et RAMPART pour le RRV et les avons appliqués aux moustiques collectés sur le terrain à partir de pièges de surveillance des arbovirus qui ont été homogénéisés pour la détection du virus. De plus, nous avons identifié des SNP dans une région variable significative de RRV et attribué des haplotypes viraux pour informer l'écologie virale dans la région des lacs Gippsland de Victoria.

Les homogénats de broyage de pièges entiers de moustiques RRV positifs et les isolats dérivés de cultures de cellules RRV utilisés dans cette étude sont répertoriés dans le tableau 1; la ventilation par spéciation des moustiques pour les pièges, le cas échéant, est fournie (voir fichier complémentaire 1). Des moutures de pièges entiers de moustiques ont été préparées à partir de collectes de moustiques pendant la nuit à partir de sites d'échantillonnage de la Fig. 1, en utilisant des méthodes décrites précédemment [41] et des isolats dérivés de cultures cellulaires [42].

Carte des sites agricoles d'échantillonnage des moustiques Victoria à Gippsland, Victoria. La carte illustre les sites d'échantillonnage de 2019 à 2022 qui ont été utilisés dans cette étude. Cartes dérivées du site Web de Google Maps

Pour confirmer la présence de RRV et évaluer la quantité relative d'acide nucléique génomique RRV dans un échantillon de piège d'homogénat de moustique (en utilisant la valeur CT), un test spécifique RRV RT-qPCR a été appliqué aux échantillons d'ARN extraits. Ce test cible le gène E2 et produit un amplicon de 67 pb. La RT-qPCR a été réalisée sur les échantillons d'ARN extraits comme indiqué [42,43,44].

Les amorces ont été conçues pour le schéma d'amplicon de pavage à l'aide du portail en ligne PrimalScheme [30]. Onze séquences du génome entier ont été sélectionnées et téléchargées comme référence dans PrimalScheme (tableau 2) ; il y avait des représentants des quatre génotypes différents du RRV, avec des génotypes comprenant G4A et G4B, qui ont été récemment détectés à Victoria, ainsi que les génotypes historiques (G2 et G1).

La séquence ARBO012 (G4B, MW489504) a été définie comme référence pour PrimalScheme pour représenter une séquence RRV contemporaine du Wellington Shire, Victoria, Australie. La longueur de l'amplicon a été fixée à 1500 bp sans les options "High GC" ni "Pinned" sélectionnées. La séquence d'amorces issue de PrimalScheme a ensuite été synthétisée par IDT (Integrated DNA Technologies, IA, USA) sous forme d'oligonucléotides avec un total de neuf paires d'amorces produisant chacune des amplicons se chevauchant de 1500 pb (tableau 3). La région variable E2/E3 de RRV a été capturée dans un seul amplicon (paire d'amorces 7) pour une analyse ultérieure de la diversité virale SNP et intra-piège. Les amorces ont été remises en suspension à une concentration de 100 µM avec deux pools d'amorces, "pair" et "impair", préparés pour l'application de carrelage, selon les méthodes du réseau ARTIC [45]. Dans chacun des deux pools d'amorces, la concentration d'amorces individuelles était de 0,015 µM par amorce, avec une concentration finale totale en pool de 100 µM. Celui-ci a ensuite été dilué pour faire une solution de travail de 10 uM et utilisé dans les réactions d'amplification par PCR suivantes.

L'ARN viral a été extrait d'homogénats de broyage de pièges entiers de moustiques (tableau 1) et de matériel RRV dérivé de culture cellulaire utilisé comme témoin positif [42]. Cinquante microlitres de cultures cellulaires infectées par le RRV et d'homogénats de broyage de pièges entiers de moustiques ont été traités à l'aide d'un kit de préparation d'isolement d'ARN viral MagMax™ standard sur le processeur MagMax™ (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) 24 Express. Pour chaque 50 µl d'homogénat de broyage de piège ou de culture de cellules virales, 65 µl de tampon de lyse ont été mélangés avec 1 µl de support d'ARN, 65 µl d'isopropanol à 100 %, 10 µl de billes d'ARN et 10 µl d'activateur d'ARN, fournis dans le kit MagMax™. Deux cycles chacun des lavages un et deux ont été utilisés (150 ul chacun). L'extraction finale a été éluée dans 50 ul de tampon d'élution.

La synthèse de l'ADNc a été réalisée sur l'ARN extrait en utilisant 2 µl de 5X LunaScript RT SuperMix (New England Biolabs, MA, USA), qui contient des hexamères aléatoires, et cela a été combiné avec 8 µl de l'ARN extrait et incubé à 25 °C pendant 2 min, 55 °C pendant 10 min suivi d'une incubation finale à 95 °C pendant 1 min. L'ADNc a été conservé à 4 ° C jusqu'à son utilisation pour l'enrichissement ciblé du RRV en utilisant le schéma d'amplification du génome entier en mosaïque.

L'ADNc dérivé des homogénats de broyage de pièges entiers de moustiques a été amplifié par PCR sur la base de la méthode d'amplification Midnight 1200 kb [46] avec des modifications majeures. Pour chaque échantillon, deux réactions ont été préparées (« impaire » et « paire », tableau 3). Chaque réaction contenait 2,5 µl d'ADNc matrice, 9,6 µl d'eau sans nucléase, 0,40 µl d'un des pools d'amorces 100 µM et 12,5 µl Q5 Hot Start Hi-Fi 2X master-mix (New England BioLabs, MA, USA) et a été PCR amplifiée dans les conditions suivantes : 98 °C pendant 30 s et 40 cycles de 98 °C pendant 15 s avec 65 °C pendant 7 min pour enrichir en RRV.

Les amplicons ont été séquencés en utilisant une combinaison de la méthode GunIt [45] et de la méthode LoCost [47] avec des modifications. Les 24 réactions PCR individuelles (deux réactions PCR mosaïques par échantillon d'homogénat de moustique) ont été combinées et diluées dans 12 pools de 50 µl contenant 2,5 µl de chaque réaction PCR mosaïque par échantillon et 45 µl d'eau sans nucléase. Pour chacune des 12 réactions PCR regroupées, 7,5 µl du produit PCR dilué correspondant, 5 µl d'eau sans nucléase, 1,75 µl de tampon de réaction Ultra End II Prep (New England BioLabs, MA, USA) et 0,75 µl Ultra End II Prep Enzyme Mix (New England BioLabs) ont été combinés et incubés à température ambiante pendant 15 min, 65 ° C pendant 15 min et incubés sur de la glace pendant 1 min.

Pour générer des échantillons à code-barres pour le séquençage, 4,2 µl du modèle en mosaïque PCR ont été combinés avec 3 µl d'eau, 2,5 µl du code-barres NB (SQK-LSK109 et EXP-NBD104, Oxford Nanopore Technologies, Royaume-Uni), 10 µl Blunt/TA Ligase Master Mélanger (New England BioLabs) et 3 µl d'eau. Le mélange a été incubé à température ambiante pendant 20 min, à 65 °C pendant 10 min et sur de la glace pendant 1 min.

Vingt microlitres des réactions à code-barres ont été regroupés pour former la bibliothèque finale pour le séquençage et combinés avec des billes ProNex (Promega, WI, USA) à 0,7 × la quantité de volume regroupé (168 µl de billes). Le mélange a été incubé pendant 5 minutes à température ambiante et le surnageant a été éliminé lorsqu'il était clair. Les billes ont été lavées deux fois en les remettant en suspension dans 250 ul de tampon de fragment court (Oxford Nanopore Technologies, Royaume-Uni), mélangées et culottées et le surnageant a été jeté. Les billes ont ensuite été lavées dans 200 ul d'éthanol à 70 % (température ambiante), en prenant soin de ne pas perturber le culot. L'éthanol a été éliminé et le culot séché pendant environ 1 min ou jusqu'à ce qu'il soit brillant. Le culot a été remis en suspension dans 31 µl de tampon d'élution (Oxford Nanopore Technologies), incubé pendant 2 min et transféré dans un tube Eppendorf propre, formant la bibliothèque d'acides nucléiques pour le séquençage. Une aliquote de 1 µl de la bibliothèque a été quantifiée sur Qubit Flex (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) à l'aide d'un kit dsDNA High Sensitivity.

Pour la ligature des adaptateurs de séquençage aux échantillons à code-barres, le total de la bibliothèque MinION réparée aux extrémités (30 µl) a été combiné avec 10 µl de tampon de réaction de ligature rapide NEBNext (5×), 5 µl de mélange d'adaptateurs (AMII) et 5 µl Quick T4 DNA Ligase et incubé à température ambiante pendant 20 min. Des billes ProNex, dans un rapport de 0,7 × le volume de la bibliothèque, ont été ajoutées au mélange ci-dessus (35 µl de billes) et incubées pendant 5 min à température ambiante avec le surnageant éliminé lorsqu'il était clair. Les billes en culot ont été lavées avec 250 ul de tampon de fragment court (Oxford Nanopore Technologies, Royaume-Uni); le surnageant a été retiré et lavé à nouveau. Le culot a été remis en suspension dans 13 µl de tampon d'élution (Oxford Nanopore Technologies), incubé pendant 2 min à température ambiante et l'éluat a été collecté pour le séquençage. Un microlitre de la bibliothèque ligaturée de l'adaptateur de séquence final a été quantifié sur un Qubit à l'aide du kit dsDNA.

L'échantillon élué a ensuite été chargé sur une Flow Cell MinION pré-préparée, en suivant les procédures standard de chargement et de séquençage MinION (ADN génomique par ligature, version GDE_9063_v109_revAJ_14Aug2019).

RAMPART [34] et InterARTIC [37] ont été modifiés pour être utilisés avec RRV en suivant les instructions sur les pages GitHub respectives. Des fichiers d'amorce ont été générés pour cette étude (ensemble d'amplicons de 1500 pb) ainsi que la séquence de référence RRV qui a été annotée et chargée dans le fichier primer.json pour que RAMPART puisse l'utiliser. Un tableau de génomes RRV couvrant tous les génotypes, y compris les virus existants (G1 et G2), a également été chargé dans le fichier references.fasta pour que RAMPART effectue les étapes de cartographie de référence.

RAMPART a été utilisé pour surveiller la progression du séquençage MinION, initialement pour identifier tous les échantillons génotypiques mixtes et pour génotyper les échantillons par cartographie de référence vers le fichier references.fasta.

Pour comparer les données sur des échantillons entiers de pièges à moustiques, toutes les séquences consensus générées devaient être normalisées. Pour réduire tout biais potentiel vers les génotypes dans l'étape de cartographie de référence, une séquence RRV consensus générique a été créée. Le consensus a été généré à l'aide de 123 génomes partiels et complets téléchargés à partir du NCBI (voir fichier supplémentaire 2). Toutes les séquences ont été chargées dans Geneious (V11.0.11) et alignées à l'aide de l'algorithme MUSCLE. Les séquences ont ensuite été coupées au génome le plus court à partir des extrémités 5 'et 3'. Le consensus des séquences génomiques coupées (11 296 nt de longueur) a été exporté et utilisé comme référence pour toutes les analyses suivantes (ci-après dénommée "séquence de référence RRV"). La région E2/E3 du génome du RRV utilisée pour l'analyse à échelle fine correspondait aux nucléotides 8222–9743 de cette séquence de référence.

Le pipeline nanopolish InterARTIC a été exécuté sur les échantillons d'homogénat de pièges entiers de moustiques (post-24 h de séquençage MinION) en utilisant les paramètres définis par l'option "Virus personnalisé". Le fichier BAM résultant a été utilisé pour le traitement en aval. Seuls les échantillons de pièges d'homogénat de moustiques qui ont généré les neuf amplicons ont été utilisés pour l'analyse de la séquence du génome entier. Des échantillons de pièges d'homogénat de moustiques qui ont généré le septième amplicon correspondant à la région E2/E3 du génome du RRV ont été utilisés pour l'analyse des SNP mineurs et l'analyse des haplotypes.

Le fichier BAM a été exécuté via la commande BCFtools [38] (V 1.14-GCC-11.2.0) suivante pour la génération du génome entier [bcftools mpileup -a INFO/AD -O u -d 10 000 -L 9000 -f reference.fasta trié /bam/from/nanopolish.sorted.bam| bcftools appelle -mv -O u | bcftools norme -O u -f référence.fasta | filtre bcftools -O u -i'%QUAL > 180' | bcftools view -O v -i "(INFO/AD[1]/INFO/DP) > 0.45" > barcode.vcf | bcftools consensus barcode.vcf > barcode_consensus.fasta]. La séquence consensus du génome entier résultante de chaque échantillon individuel de piège d'homogénat de moustique a été utilisée dans l'analyse phylogénétique.

Une analyse phylogénétique du maximum de vraisemblance (ML) a été réalisée à l'aide (i) de séquences consensus du génome entier recueillies auprès du NCBI, (ii) de séquences générées à partir des 16 pièges à moustiques entiers positifs pour le RRV, (iii) de deux témoins positifs (ARBO012-MinION01 et ARBO012-MinION02 ; Tableau 2) et (iv) séquences incluses dans une précédente étude RRV [19]. L'arbre ML a été généré par MEGA11 [48], après alignement avec MAFFT [49], en utilisant le module General Time Reversable dans MEGA11 et une valeur bootstrap de 1000.

L'analyse de la séquence de la région E2/E3 du génome du RRV a été réalisée avec SAMtools [38] (1.15-GCC-11.2.0) et iVar [50] avec la commande suivante [samtools mpileup -aa -A -d 1 000 000 -B -Q 0 -f reference.fasta bam/file/from/nanopolish/.sorted.bam -r NCBI:8222-9743 | ivar variants -p sample_name -q 20 -t 0.03 -r reference.fasta -m 30]. Les fichiers .tsv ultérieurs ont été examinés et tous les indels ont été supprimés car ils ont été jugés non fiables pour une analyse à grande échelle. Les SNP restants ont été utilisés pour une analyse à échelle précise et ont été comparés entre les pièges pour examiner la cohérence et la variation potentielle. Les SNP ont été transférés dans un fichier .csv où ils ont ensuite été utilisés pour l'identification manuelle des haplotypes à travers les pièges examinant les fréquences et les positions des nucléotides. Les SNP ont été appelés en utilisant un seuil inférieur à celui de l'analyse du génome entier (3 % des lectures par rapport au réglage standard pour BCFtools).

L'haplotypage des échantillons de pièges a été effectué par inspection visuelle de l'alignement en accordant une attention particulière aux fréquences SNP mineures identifiées via le fichier .csv. Des haplotypes spécifiques pour chaque piège ont été déterminés par la présence ou l'absence de certains SNP dans la région E2/E3 du génome du RRV jusqu'à ce que tous les SNPS de tous les isolats soient attribués à des haplotypes. Les lectures ont été inspectées manuellement pour s'assurer que les SNP d'haplotype correctement attribués étaient présents à l'aide de l'IGV (version 2.5.0 [51,52,53]) et de la tablette (version 1.21.02.08 [54]). L'analyse phylogénétique des haplotypes a été réalisée dans MEGA11 comme indiqué ci-dessus dans l'analyse WGS.

Les analyses RAMPART et InterARTIC ont indiqué que le RRV, présent dans les 20 homogénats de pièges à moustiques collectés dans le Wellington Shire, Victoria, appartenait à un seul génotype, G4A. Seize des homogénats de pièges à moustiques ont produit une couverture suffisante sur les neuf amplicons (indiquée par la présence des neuf amplicons à une couverture> 20 ×) pour permettre l'assemblage de séquences génomiques entières de RRV et l'analyse phylogénétique ultérieure.

L'analyse phylogénétique du maximum de vraisemblance des 16 séquences consensus du génome entier a confirmé le regroupement des échantillons au sein de G4A (Fig. 2). Il n'y avait pas de regroupement spatio-temporel des 16 séquences consensus génomiques analysées de Wellington Shire entre 2020 et 2022 (Fig. 2).

Arbre phylogénétique du maximum de vraisemblance (ML). Arbre phylogénétique de génomes RRV entiers à l'aide d'un modèle GTR, bootstrap 1000. L'arbre utilise des séquences nucléotidiques consensus du génome provenant de 16 pièges à moustiques collectés à six endroits. L'analyse comprend le contrôle de séquençage RRV-positif (un isolat dérivé de la culture cellulaire, ARBO012) qui a été inclus dans les deux séquences de séquençage MinION. Les séquences se distinguent dans leurs génotypes par la couleur

Il n'y avait pas de séquences de pièges à génome entier identiques de RRV entre les pièges à homogénat de moustiques. Les séquences du génome entier du RRV les plus diverses se situaient entre le piège HS-22-Jan et MP-20-Mar-5, qui différaient de 34 nucléotides sur l'ensemble du génome (divergence de 0,3 % sur 11 296 nt). Les séquences du génome entier du RRV les plus similaires provenaient des pièges MP-20-Mar-2 et WP-20-Mar-1, qui différaient d'un seul nucléotide sur l'ensemble du génome (Fig. 2).

Sur les 20 pièges séquencés dans cette étude, 18 ont produit un amplicon E2/E3 de pleine longueur qui a été utilisé pour la détection des SNP à une fréquence > 3 % de toutes les lectures pour prendre en charge l'analyse des haplotypes à petite échelle.

Les données de séquence de contrôle positif (ARBO012) générées à partir de deux cycles de séquençage étaient toutes deux identiques à la séquence de référence précédemment générée (basée sur Illumina) sur l'amplicon E2/E3, ce qui indique qu'il n'y avait pas de variation entre les cycles entre l'analyse SNP dans la région variable .

Vingt SNP ont été détectés sur l'amplicon E2/E3 de 1500 pb à partir de 18 pièges. Sept des 20 SNP ont entraîné des changements d'acides aminés, l'un des sept SNP générant un codon stop (Fig. 3). À partir des 20 SNP, dix haplotypes uniques ont été déterminés (Fig. 3). Phylogénétiquement, les dix haplotypes différents étaient représentés dans trois clades différents (étiquetés 1–3). Les haplotypes RRV manquaient de structure spatio-temporelle, l'haplotype le plus important, 2,2, étant détecté dans neuf pièges distincts, au cours des trois années échantillonnées et dans les six emplacements (Fig. 4B, Tableau 4). Cet haplotype a été détecté à GB trois fois sur une période de 10 mois (entre avril 2020 et janvier 2021 ; tableau 4). Le deuxième haplotype le plus courant était 3,1, détecté dans sept pièges sur 1 an dans les emplacements MP, WP et LS (Fig. 4B, Tableau 4). Cet haplotype a été détecté à MP deux fois sur 13 jours en mars 2020 lors de deux événements de piégeage différents. Huit haplotypes n'ont été observés qu'une seule fois dans un événement de piégeage (1, 1 et 1, 2 dans HS, 3, 2, 3, 4 et 2, 1 dans MP, 3, 3 dans WP et 2, 3 et 2, 4 dans GB; Fig. 4B, tableau 4).

Intra-piège à moustiques Diversité RRV E2/E3 et analyse génétique de différents haplotypes observés à travers Wellington Shire. Illustration schématique de l'Amplicon 7 (région E2/E3 8222–9743nt) avec toutes les mutations d'haplotype désignées à partir de la séquence RRV consensus générique. Les haplotypes (1.1 à 3.4) sont listés à gauche. MEGAX a été utilisé pour visualiser l'alignement et traduire les bases nucléotidiques en résidus d'acides aminés

Diversité temporelle des pièges intra-moustiques de RRV E2/E3. Un arbre phylogénétique à vraisemblance maximale (ML), modèle GTR, bootstrap 1000 des haplotypes RRV générés à l'aide de MEGAX. Les haplotypes se distinguent dans leurs génotypes par la couleur. Tous sont des haplotypes du même génotype, G4A. B Illustration graphique de la variation spatio-temporelle de l'haplotype RRV E2/E3. Chaque piège est représenté par un camembert avec la proportion et le nombre d'haplotypes illustrés avec les couleurs correspondantes. Cartes dérivées du site Web de Google Maps

Des haplotypes mixtes ont été détectés dans cinq des 18 pièges. Dans chacun des cinq pièges à haplotypes mixtes, le pourcentage de fréquence des haplotypes mineurs variait de 0,7 à 18 %. Dans quatre pièges mixtes, seuls deux haplotypes ont été observés, un piège de GB en 2022 montrant un mélange de trois haplotypes. Le SNP qui a abouti au codon stop était présent dans l'haplotype 1.2 et n'a été trouvé qu'une seule fois dans un piège qui avait deux haplotypes et a été détecté à une fréquence de 17,6 % des lectures E2/E3 dans ce piège.

Le séquençage du génome entier et l'épidémiologie génomique sont de plus en plus utilisés pour comprendre la diversité virale lors d'une épidémie ou d'une épidémie. Avec la capacité de détecter des variantes mineures et de suivre ces variantes dans le temps et entre les lieux, les données génomiques se sont révélées utiles pour surveiller les épidémies. L'analyse des séquences du génome viral peut éclairer la compréhension de l'écologie et de la transmission des virus [55]. De plus, l'analyse des séquences du génome peut identifier les changements potentiels d'acides aminés ou de nucléotides qui peuvent affecter la virulence et par la suite la pertinence des tests de diagnostic et des vaccins [56]. Dans cette étude, nous avons développé un nouveau pipeline bioinformatique pour le RRV, un important arbovirus transmis par les moustiques en Australie. Ce pipeline a ensuite été utilisé pour analyser une collection d'homogénats de pièges à moustiques entiers positifs au RRV afin de comprendre la structure génétique spatio-temporelle du virus dans le Wellington Shire, Gippsland, Victoria, Australie. La plateforme de séquençage MinION de la plateforme Oxford Nanopore Technologies a été sélectionnée pour cette étude en raison de sa capacité à générer des lectures de séquences plus longues à partir de génomes viraux qui permettent une analyse à grande échelle et la résolution des haplotypes viraux dans des échantillons environnementaux complexes [50]. Cela contraste avec les plates-formes de séquençage à lecture courte telles qu'Illumina, car la diversité des séquences est limitée à la longueur de lecture, ce qui entrave la capacité d'évaluer en toute confiance des génomes individuels et des haplotypes viraux [57].

G4 est le génotype contemporain le plus courant de RRV en Australie [17, 19, 58]. G4A et G4B ont tous deux été détectés à Victoria, dans le Queensland et en Australie occidentale [19, 59]. À partir des cinq séquences du génome entier de Victoria analysées précédemment, un regroupement spatial avait été détecté, avec G4B détecté uniquement dans la région des lacs Gippsland et G4A détecté dans l'intérieur du Victoria [59]. Dans cette étude utilisant RAMPART, l'amplification par mosaïque d'amplicon et le pipeline de traitement viral établi du groupe ARTIC [34], l'analyse des séquences génomiques de 20 pièges à moustiques entiers supplémentaires a révélé que G4A se trouve dans les lacs du Gippsland. Il s'agit d'une observation intéressante car, jusqu'à cette étude, seul G4B avait été observé dans le Gippsland, contrairement à l'Australie occidentale, où G4A et G4B ont été détectés dans les régions nord, sud et centrale pendant de nombreuses années [19]. L'apparition apparente de G4A dans le Gippsland dans cette étude peut refléter un sous-échantillonnage antérieur et la génération de WGS pour une analyse ultérieure.

L'absence de structure virale spatio-temporelle du RRV dans la région des lacs Gippsland et la détection de dix haplotypes viraux distincts sont compatibles avec des populations virales hétérogènes dans cette région. La détection d'une population virale hétérogène et l'absence de structure spatio-temporelle dans la région des lacs du Gippsland ne sont pas surprenants étant donné que de nombreux hôtes vertébrés et espèces de vecteurs différents peuvent être impliqués dans la transmission du RRV [6, 7, 60] et qu'ils sont présents dans le comté de Wellington local [61] . De plus, les vastes zones humides des marais salés facilitent les sites de reproduction productifs des moustiques des marais salés Ae. camptorhynchus et Ae. vigilax, avec des portées de vol rapportées de 3 [62] à 6 km [63] et jusqu'à 9 km [64] (hors dispersion assistée par le vent).

La transmission transovarienne des arbovirus (transfert viral via les œufs de moustiques) peut souvent être observée chez des moustiques mâles capturés sur le terrain qui n'auraient pas consommé de repas de sang ; par conséquent, la seule méthode pour que ces moustiques atteignent l'arbovirus est directement de la mère [9]. Cela a déjà été détecté pour d'autres arbovirus [9] (dont le virus de l'encéphalite japonaise [65] et le virus de l'encéphalite équine orientale [66]) et spécifiquement observé chez Ae. Vigilax pour RRV [67]. La détection répétée de l'haplotype 2.2 en GB sur une période de 9 mois (avril 2020 à janvier 2021) suggère que le RRV a hiverné dans les œufs de moustiques [68], car il est inférieur au taux de sous-stations nucléotidiques signalé pour le RRV [19].

Le SNP 9327 qui a produit un changement d'acide aminé dans l'haplotype 1.2 résultant en un codon d'arrêt a été détecté à une faible fréquence de 17,6 % dans un échantillon de broyage de piège entier. L'apparition du codon stop (SNP 9327) dans un échantillon d'haplotype mixte était inattendue. Cependant, des rapports de protéines tronquées et de codons d'arrêt dans les protéines structurelles ont déjà été décrits [69, 70]. Plus précisément, une mutation de décalage de cadre dans le gène S1 de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 a entraîné une protéine S1 tronquée à un faible pourcentage. Comme il y avait un grand pourcentage de protéines S entièrement formées, on a émis l'hypothèse que la protéine S1 fonctionnelle et disponible serait acquise à partir des virus fonctionnels dans l'essaim de quasi-espèces virales [69]. Un codon stop similaire a été détecté dans la protéine nsP3 du virus O'nyong'nyong, un alphavirus similaire au RRV, et il a été émis l'hypothèse que la présence du codon stop a altéré l'infectivité du virus dans le vecteur hôte Anopheles gamdiae [70].

Lors de l'utilisation de RAMPART et InterARTIC, seuls le génotype et la séquence complète du génome seront identifiés. Pour faciliter l'analyse des haplotypes viraux, des SNP mineurs à échelle fine représentant des quasi-espèces au-dessus d'un seuil de 3% de lectures ayant un nucléotide alternatif à la référence ont dû être utilisés. Dans cette étude, nous avons développé un nouveau pipeline bioinformatique utilisant iVar [50] et une évaluation visuelle des SNP liés individuels sur la région E2/E3 pour mesurer la variation intra-hôte.

Les programmes d'analyse SNP tels que BCFtools call [38], LoFreq [71], FreeBayers [72], WhatsHap [73, 74], VirStrain, HaploFlow, HaploClique, Shorah, nanopolish [75], etc. car ils appliquent un niveau de seuil trop élevé pour détecter des allèles mineurs et signalent plutôt un consensus à partir du piège plutôt que les séquences représentatives du génome au sein de l'essaim viral.

Les amorces du génome complet développées dans ce test ne couvraient que le CDS du RRV. L'exclusion des UTR 3 'et 5' peut entraîner des mutations manquées dans le virus, ce qui constitue une limitation de l'étude.

Avec la capacité de détecter les allèles mineurs des populations de moustiques, une image plus complète des souches RRV en circulation peut être comprise. Une surveillance accrue pourrait montrer la propagation de certains haplotypes viraux et pourrait être appliquée pour comprendre la taille de la population au cours d'une saison donnée. Les méthodes développées ici pourraient également être appliquées à d'autres arbovirus transmis par les moustiques et d'importance pour la santé publique.

Les ensembles de données générés à partir de cette étude sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant.

Aedes

Acide désoxyribonucléique complémentaire

Séquence de codage

Seuil de cycle

Culex

Acide désoxyribonucléique double brin

Protéine d'enveloppe 2/3

Golden Beach, Wellington, Victoria

Interface utilisateur graphique

Holland's Landing, Wellington, Victoria

Chèvrefeuilles, Wellington, Victoria

Loch Sport, Wellington, Victoria

Pointe Marley, Wellington, Victoria

Réaction en chaîne par polymérase

Lire l'affectation, la cartographie et l'analyse phylogénétique en temps réel

Acide ribonucléique

Virus de la rivière Ross

Réaction en chaîne par polymérase quantitative de transcription inverse

Polymorphisme d'un seul nucléotide

Région non traduite

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Tas de bois, Wellington, Victoria

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Les auteurs tiennent à remercier James Ferguson pour la création d'InterARTIC et son aide dans l'utilisation du programme. Les auteurs tiennent également à remercier Nikki Freed pour son aide dans l'optimisation de l'approche d'amorce carrelée de laboratoire humide répertoriée ici. Enfin, les réviseurs et les éditeurs pour le temps qu'ils ont consacré à la rédaction de cet article.

EDV est soutenu par une bourse de formation à la recherche du gouvernement australien fournie par le ministère de la Défense ; Defence, Science and Technology Group, Agriculture Victoria et La Trobe University et est également soutenu par une subvention supplémentaire (ID: G12017SRodoniLaT459) du Defence Science Institute.

Agriculture Victoria, AgriBio, Centre for AgriBioscience, Bundoora, VIC, 3083, Australie

Ellen M. de Vries, Noel OI Cogan, Brendan C. Rodoni et Stacey E. Lynch

École de biologie des systèmes appliqués, Université La Trobe, Bundoora, VIC, 3083, Australie

Ellen M. de Vries, Noel OI Cogan et Brendan C. Rodoni

Division des capteurs et des effecteurs, Groupe des sciences et technologies de la défense, Fishermans Bend, VIC, 3207, Australie

Aneta J. Gubala

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EDV a effectué toute l'analyse, le travail technique et a préparé la première ébauche du manuscrit. NOIC, AG, BCR et SEL ont tous contribué au développement des idées présentées ici, aidé à la rédaction et à l'édition du manuscrit et supervisé le projet. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Ellen M. de Vries.

N'est pas applicable.

N'est pas applicable.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Spéciation de moustiques à partir de pièges échantillons. Données tabulées de toutes les espèces de moustiques et nombres détectés dans les pièges utilisés pour le séquençage RRV. Seuls les pièges qui avaient des données applicables sont affichés.

Génomes RRV utilisés pour la génération d'un génome complet pour la standardisation ; 123 séquences du génome entier du RRV utilisées pour générer un fichier consensus singulier pour standardiser toutes les séquences du génome entier du RRV générées. Toutes les séquences sont répertoriées avec leur numéro d'accès et ont été téléchargées à partir du NCBI.

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Réimpressions et autorisations

de Vries, EM, Cogan, NOI, Gubala, AJ et al. Suivi génomique à petite échelle du virus de Ross River à l'aide du séquençage des nanopores. Vecteurs parasites 16, 186 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05734-z

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Reçu : 29 novembre 2022

Accepté : 11 mars 2023

Publié: 06 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1186/s13071-023-05734-z

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