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Aug 11, 2023

Un microbiome sombre et des matières organiques extrêmement faibles dans le delta fossile d'Atacama dévoilent les limites de détection de la vie sur Mars

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 808 (2023) Citer cet article

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Identifier des signes non équivoques de vie sur Mars est l'un des objectifs les plus importants pour envoyer des missions sur la planète rouge. Nous rapportons ici Red Stone, un delta alluvial fan-fan de 163-100 Ma qui s'est formé dans des conditions arides dans le désert d'Atacama, riche en hématite et en mudstones contenant des argiles telles que la vermiculite et les smectites, et donc géologiquement analogue à Mars. Nous montrons que les échantillons de Red Stone présentent un nombre important de micro-organismes avec un taux inhabituellement élevé d'indétermination phylogénétique, ce que nous appelons le "microbiome sombre", et un mélange de biosignatures de micro-organismes existants et anciens qui peuvent à peine être détectés avec l'état de - équipement de laboratoire à la pointe de la technologie. Nos analyses par des instruments de banc d'essai qui sont ou seront envoyés sur Mars révèlent que bien que la minéralogie de la pierre rouge corresponde à celle détectée par des instruments au sol sur la planète rouge, des niveaux similaires de matières organiques seront difficiles, voire impossibles à détecter dans Roches martiennes selon l'instrument et la technique utilisés. Nos résultats soulignent l'importance de renvoyer des échantillons sur Terre pour déterminer de manière concluante si la vie a jamais existé sur Mars.

Les missions passées, actuelles et futures vers Mars sont principalement motivées par la question en suspens de savoir si la vie a jamais existé sur la planète rouge1. Des missions terrestres telles que Mars Exploration Rovers, Phoenix et les rovers actifs Mars Science Laboratory (MSL) et Mars2020 ont été chargées d'identifier les environnements habitables et de déterminer s'il existe des preuves des exigences de la vie telle que nous la connaissons2,3. L'eau liquide est l'une des principales exigences, c'est pourquoi de nombreux rovers ont atterri sur des sites présentant des preuves géomorphologiques d'anciennes rivières et lacs et/ou des preuves minéralogiques d'eau liquide, comme des minéraux argileux4,5,6. Ces engins spatiaux sont équipés de divers instruments de composition pour identifier les minéraux et rechercher les molécules brutes nécessaires à la vie. Les spectromètres de masse sur Viking, Phoenix, MSL, Mars2020 et le futur rover ExoMars, par exemple, peuvent détecter des molécules organiques et les éléments constitutifs de la vie7,8,9,10. Bien qu'aucune preuve solide de la présence de matières organiques dans les sols martiens n'ait été trouvée par les mesures de Viking ou de Phoenix11,12, la suite d'instruments Sample Analysis at Mars (SAM) sur MSL et l'instrument Scanning Habitable Environments with Raman and Luminescence for Organics and Chemicals (SHERLOC) sur Mars2020 a identifié des molécules organiques aliphatiques et aromatiques simples (c.-à-d. ~ 450 ppm dans le mudstone de la baie de Yellowknife au cratère Gale13,14).

Les résultats de Mars suggèrent jusqu'à présent que les matières organiques ne sont pas répandues à sa surface, mais ici nous émettons l'hypothèse que les limitations actuelles des instruments15 et la nature des matières organiques dans les roches martiennes peuvent également entraver notre capacité à trouver des preuves de la vie sur la planète rouge. Dans ce travail, nous testons ces limitations en inspectant de près Red Stone, un site unique situé dans le désert d'Atacama, le plus sec16,17,18, le plus ancien désert de la Terre19,20,21,22,23,24, et un Mars bien connu. modèle analogique22.

La pierre rouge est située au sud de la ville d'Antofagasta dans la Quebrada del Boku (gouttière de Boku) (Fig. 1A, B et Fig. 2), une partie du groupe supérieur de Way, une séquence sédimentaire d'un delta alluvial fan-fan composé de les formations du Coloso et du Lombriz datant du Crétacé inférieur au Jurassique supérieur (Fig. 1C et Fig. 2B)25. Le groupe Way représente deux phases distinctes de l'évolution du bassin, enregistrant la succession complète du delta proximal à distal jusqu'à l'incursion marine progressive ultérieure et le dépôt du delta26. La base de la formation de Lombriz montre des grès rouges et des mudstones intercalés avec des veines perpendiculaires abondantes et des croûtes d'halite indurée (Fig. 1D, E et Fig. 3). En remontant les sections, on trouve des unités de conglomérats cimentés, de grès intercalés et de mudstones, surmontés de conglomérats lâches altérés (Fig. 1E et Fig. 3).

Un emplacement de pierre rouge dans le désert d'Atacama (modèle numérique de terrain86). B Zoom image satellite dans la région environnante (données satellite Sentinel 2020). C Reconstruction paléogéographique du système alluvial/delta illustré en B, selon l'enregistrement sédimentaire rapporté de la formation Caleta Coloso-El Way (modifié à partir de Flint, S. Clemmey, H. & Turner, P. The Lower Cretaceous Way Group of Northern Chili: un complexe alluvial fan–fan delta Sediment. Geology 46, 1-22 (1986)25,87). Les flèches noires en C indiquent le sens de l'écoulement de l'ancien delta du fleuve, dont le point d'origine se trouve maintenant sous l'océan Pacifique. Le point rouge en A, B et C montre l'emplacement de l'affleurement montré dans E. D Colonne stratigraphique de l'affleurement étudié montré dans le panneau E. Les flèches rouges montrent les points de collecte des échantillons. E Vue rapprochée de l'affleurement étudié. De haut en bas : UZ zone supérieure, U1 Unité 1, WI mur dans l'emplacement du capteur, U2 Unité 2, WO mur hors emplacement du capteur, LZ zone inférieure.

Une vue panoramique du site inspecté. B Carte géologique de la formation Caleta Coloso-El Way (SERNAGEOMIN, 2003. Mapa Geológico de Chile : version digital88). JK1c (vert clair); séquences sédimentaires transitionnelles alluviales, fluviales et éoliennes. Crétacé inférieur à Jurassique supérieur (grès, calcaire, lutite, conglomérat, siltite). Ki1m (vert); séquences sédimentaires marines côtières. Crétacé inférieur (grès, calcaire, limon, calcarénite). M1c (marron clair); séquences sédimentaires du cône alluvial. Miocène (sable, gravier, limon, ignimbrite). J3i (violet clair); séquences volcaniques continentales et marines du Jurassique (basaltes, andésite, tuf, calcaire).

A Top conglomérats lâches altérés. B Conglomérats cimentés. C, D Montrent des grès (s) avec des mudstones en couches fines (m). Les flèches blanches indiquent les veines d'halite/gypse. E L'une des veines d'évaporite a été brisée, exposant l'halite/gypse à l'intérieur et la fine couche d'hématite qui les recouvre. F Croûte fibreuse d'halite parallèle à la surface de l'affleurement, observable uniquement après mise à nu.

L'assemblage minéral secondaire du faciès sédimentaire de la pierre rouge présente des similitudes avec l'ancienne Mars, suggérant des histoires diagénétiques comparables. En plus du quartz et du plagioclase, les grès sont composés de zéolithe (analcime), de calcite, de gypse, d'halite, de chlorite, de vermiculite, d'illite/muscovite et d'hématite (Fig. S1A). L'hématite est un marqueur d'altération aqueuse oxydative sur Mars27,28,29 et est présente dans la pierre rouge sous forme de cristaux bien développés et de fines couches minérales (Fig. S1B, C), donnant ainsi une couleur rouge caractéristique à ce site (Fig. 2A ). La présence d'halite et de gypse, de veines blanches et de croûtes transversales dans les faciès inférieurs de grès et de mudstone de pierre rouge, en plus de l'halite cimentant le faciès supérieur de grès (Fig. 1D, E et Fig. 3), soutient des conditions arides pendant le dépôt de les sédiments de ce delta (l'halite et le gypse ont été identifiés dans les anciennes surfaces martiennes depuis l'orbite et in situ30,31,32,33). Les phyllosilicates sont abondants dans les anciennes surfaces martiennes et sont dominés par la smectite et la chlorite34. De même, les mudstones Red Stone contiennent de la smectite (saponite et montmorillonite) et de la chlorite, ainsi que de l'illite et de la vermiculite (Fig. S1A et Fig. S1D). La présence de chlorites suggère des conditions diagénétiques à basse température (70-90 °C)35, similaires aux températures subies par les roches sédimentaires du cratère Gale étudié par MSL36. Les diagrammes de diffraction des rayons X (DRX) à différentes humidités relatives (HR) montrent que la position maximale du chlorite se déplace légèrement en raison de l'étalement de la distance entre les couches, ce qui suggère que le chlorite peut absorber de petites quantités de vapeur d'eau en réponse aux changements de l'environnement. l'humidité relative (HR) (Fig. S2), une découverte intéressante pour l'inspection de l'habitabilité potentielle de ce type d'argile sur Mars. Le ciment analcime, ainsi que les argiles authigènes, la calcite et le quartz37, sont typiques de l'évaporation des saumures dans des bassins fermés, semblables aux lacs qui se sont formés dans les bassins d'impact sur Mars il y a environ 3 à 4 milliards d'années38. Schémas d'altération utilisant l'analyse A-CN-K [Al2O3-(CaO + Na2O) - K2O]39,40 (Fig. S3A), ainsi que ACN [Al2O3-(CaO + Na2O)] et A-CNK-FM [Al2O3 - ( CaO + Na2O + K2O) - (FeOT + MgO)] les analyses géochimiques (Fig. S3B, C) sont également indicatives de la diagenèse, et les variations de l'ACN dans certains des échantillons suggèrent également d'autres processus en action tels que l'hydrothermalisme.

Les enregistreurs in situ à double température / humidité relative ont montré que les conglomérats lâches supérieurs les plus exposés affichaient les valeurs d'humidité relative les plus élevées (Fig. S4), avec jusqu'à 85,1% pendant la nuit et tôt le matin, ce qui correspond à l'exposition régulière aux brouillards dans cette région comme principale source d'eau pour la vie microbienne41.

Les échantillons de pierre rouge contiennent au plus 1 μg d'ADN par gramme de sol, avec des analyses de séquençage de nouvelle génération (NGS) d'ARNr 16 S montrant que le plus grand nombre d'espèces se trouvait parmi les Alphaprotéobactéries et les Actinobactéries (Fig. 4A et Tableau S1). La plus grande diversité d'unités taxonomiques opérationnelles (OTU) a été trouvée dans les conglomérats altérés les plus élevés (Fig. 4B), ce qui correspond à la plus grande disponibilité d'eau. Une corrélation entre les valeurs d'HR les plus élevées et la diversité microbienne NGS a confirmé le nombre élevé d'OTU dans les conglomérats les plus élevés (Fig. S5A), dévoilant également un nombre légèrement plus élevé d'OTU dans la zone où se trouvent les évaporites, en accord avec le rôle de ces derniers. minéraux en fournissant une source d'eau pour la vie microbienne en raison de l'absorption de vapeur d'eau en réponse aux changements d'humidité relative. Les OTU de la zone supérieure se trouvent également dans la zone où les températures de surface les plus élevées sont enregistrées pendant la journée (Fig. S4 et Fig. S5B), ce qui suggère que ces espèces sont au moins thermotolérantes.

Une carte thermique des principaux phylums bactériens déterminée par NGS. Les nombres représentent des pourcentages du nombre total de séquences. L'intensité de la couleur dans chaque case indique le pourcentage relatif de chaque embranchement. B Indices de richesse (S, barres) et de diversité de Shannon (H', points) pour les communautés procaryotes analysées. C Classement hiérarchique des séquences bactériennes trouvées par NGS. Les couleurs d'échelle de gris identifient les classifications hiérarchiques supérieures.

Une fraction substantielle des séquences d'ARNr NGS 16 S tombait dans la catégorie "non classées" (8, 9%) (Fig. 4A), tandis que 40, 8% des séquences restantes ne pouvaient pas être attribuées au-delà de taxons supérieurs tels que l'ordre ou le domaine (Fig. 4C), dévoilant ainsi un degré inhabituellement élevé d'indétermination phylogénétique. Le concept de "matière noire microbienne" a été récemment proposé pour désigner la partie encore inexplorée de la diversité microbienne composée de micro-organismes non caractérisés issus de phylums connus et de phylums candidats sans représentants cultivés42,43,44. Ici, nous proposons plutôt le nouveau concept de "microbiome sombre" pour désigner la communauté de micro-organismes qui peuvent être détectés avec des méthodes à haut débit telles que le séquençage direct de l'ADN (comme c'est le cas des échantillons de pierre rouge), mais dont l'identité phylogénétique ne peut toujours pas être déterminé. Ainsi, le microbiome sombre de la pierre rouge peut être composé d'espèces existantes véritablement nouvelles que l'on ne trouve nulle part ailleurs sur Terre, mais il se peut également que ce microbiome sombre représente en fait la communauté relique d'espèces microbiennes qui habitaient le delta de la pierre rouge. dans un passé lointain, dont aucun parent existant ne se trouve dans les bases de données de séquences existantes.

Une approche dépendante de la culture nous a permis d'obtenir seulement dix-neuf isolats bactériens uniques et deux fongiques à partir de l'ensemble des échantillons de pierre rouge (Fig. S6), avec un nombre extrêmement faible d'unités formant colonies (UFC) (1,1 × 101 - 9,0 × 101, Tableau S2), et la quasi-totalité des espèces bactériennes appartenant à la famille Bacillaceae des bactéries hétérotrophes, en accord avec les résultats du NGS. La majorité de ces espèces correspondaient de manière unique à la minéralogie des échantillons d'où elles avaient été isolées (c'est-à-dire que Halobacillus a été trouvé dans des échantillons d'évaporites), reflétant ainsi leurs préférences écologiques. Toutes les bactéries isolées de ce site sont connues pour utiliser la poussière éolienne pour se déplacer à travers l'Atacama45, suggérant que la région côtière dans laquelle se trouve Red Stone est le principal point d'origine de nombreuses espèces trouvées à l'intérieur des terres.

L'analyse élémentaire a révélé de très faibles teneurs en carbone organique total (COT) provenant de cet assemblage unique de micro-organismes, avec un maximum de 0,11 % de poids sec et aucun azote détectable (tableau 1). La chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) a montré que la fraction lipidique de ce COT était principalement composée d'hydrocarbures et d'acides gras (Fig. 5A). L'analyse isotopique stable du carbone a montré des valeurs de δ13C de -19,5 à -26,5‰ (Fig. 5B), les échantillons d'évaporite étant les plus enrichis et ayant le COT le plus élevé. Les lipides caractéristiques des membranes eucaryotes, tels que les stérols, n'ont pas pu être détectés par GC-MS. La présence d'acides gras avec un groupe méthyle à l'avant-dernière position de la chaîne acide (c'est-à-dire, iso-17:0) suggère des apports bactériens où les bactéries sulfato-réductrices peuvent représenter une fraction substantielle46. L'enrichissement en 13C observé dans les évaporites par rapport à d'autres échantillons, ainsi que la détection d'acides gras monoinsaturés, d'isoprénoïdes (pristane et phytane), d'heptadécène et d'un certain nombre d'alcanes monométhyliques à chaîne moyenne, suggèrent une origine dans des phototrophes comme les cyanobactéries47,48,49 . Cependant, puisque ni le NGS, ni les analyses microscopiques (champ clair et autofluorescence de la chlorophylle), ni la culture n'ont détecté de telles espèces, ces biosignatures peuvent en fait représenter les restes anciens des membres phototrophes du microbiome sombre qui habitaient l'éventail alluvial de la pierre rouge avant sa lithification. . Cette hypothèse est également cohérente avec l'analyse des échantillons de mudstone, qui a également révélé la présence d'une série d'hopanes des carbones C27 à C31 (Fig. 5A). Les hopanes sont les fossiles moléculaires les plus récalcitrants des hopanoïdes, des lipides de type stéroïde de la famille des isoprénoïdes produits principalement par des bactéries50, là encore une biosignature potentielle des anciens habitants du delta de la pierre rouge.

A Teneur en lipides, y compris les alcanes normaux (c'est-à-dire à chaîne droite), les acides gras normaux et les acides gras monoinsaturés (MUFA) identifiés par spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse (GC-MS). Les plages de nombres de carbone sont indiquées entre parenthèses. B Valeurs de carbone organique total (TOC, % ps) et de composition isotopique stable du carbone (δ13C, ‰) trouvées. C, D et E montrent les échantillons analysés par spectroscopie Raman, tandis que (F) montre un contrôle positif dans lequel un lipide a été déposé sur un substrat riche en silice amorphe (panneau F modifié avec la permission de Carrizo et al.89).

Le rapport de la somme des n-acides gras sur la somme des n-alcanes peut fournir une mesure de la fraîcheur de la biomasse dans un environnement donné. Comme les groupes fonctionnels oxygénés tels que le carboxyle ont tendance à se décomposer avec le temps, tandis que les hydrocarbures plus résistants s'accumulent (c'est-à-dire les alcanes), des rapports n-acides gras/n-alcanes relativement élevés peuvent être interprétés comme le signe d'une biomasse plus fraîche51. Les échantillons de la partie supérieure de la stratigraphie et des évaporites ont montré les ratios les plus élevés (≥16 ; tableau 1), ce qui suggère que ces échantillons contiennent la biomasse la plus fraîche/la plus récente, ce qui correspond à la diversité microbienne la plus élevée déterminée par NGS et à la plus grande disponibilité d'eau dans ces échantillons.

La spectroscopie Raman utilisant une source de 532 nm, similaire à la suite d'instruments SuperCam du rover Mars 2020, a confirmé la présence des minéraux détectés par XRD (Fig. S7), mais n'a trouvé aucune signature lipidique (Fig. 5C – F) , dévoilant le choix critique approprié des paramètres Raman tels que la source laser et la taille du spot dans la détection de différents types de matières organiques lorsque les concentrations sont extrêmement faibles.

La coloration de l'ADN SYBR Green a réussi pour un seul échantillon de la zone inférieure, qui a dévoilé quelques cellules coccoïdes et bacillaires (Fig. S8). Cependant, l'hybridation in situ Catalysed Reporter Deposition-Fluorescence (CARD-FISH) a pu détecter des niveaux extrêmement faibles de bactéries et d'archées (Figs. S9, S10) dans tous les échantillons, avec les comptages les plus élevés (seulement 6 × 105 cellules par gramme de échantillon) observés dans les échantillons de conglomérats supérieurs, là encore cohérents avec ces échantillons ayant la plus grande biodiversité et disponibilité en eau.

Étant donné que plusieurs des techniques utilisées pour caractériser d'abord les échantillons de pierre rouge ont donné des preuves de la vie à la limite de détection, il était intéressant d'inspecter ce qu'une suite d'instruments de banc d'essai sur et à envoyer sur Mars détecterait dans les échantillons de pierre rouge, comme les missions actuelles et futures étudient spécifiquement des éventails/deltas similaires riches en argile52,53.

Alors que des techniques telles que DRIFTS (Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy), RLS (Raman laser spectrometer ExoMars simulator) et LIBS (Laser Induced Breakdown Spectroscopy onboard the Curiosity and Perseverance rovers) correspondaient étroitement à la composition minéralogique du site (Figs. S11– S13, Tableau S3 et Tableau S4), la détection des matières organiques s'est avérée beaucoup plus difficile.

La détection DRIFTS des matières organiques était à peine possible dans la région NIR (Fig. S11A), car des bandes plus fortes provenant des vibrations dans les réseaux minéraux obscurcissaient les bandes potentielles des matières organiques. Un seul pic à 1,36 μm dans les spectres de l'échantillon Red Stone pourrait être expliqué par des bandes non fondamentales de matières organiques. En revanche, de nombreuses bandes (bien que très faibles) attribuables aux matières organiques ont été observées dans la région spectrale de l'infrarouge moyen (MIR) (Fig. S11B; affectations dans le tableau S5).

La pyrolyse de type SAM54 d'échantillons de pierre rouge a détecté un certain nombre de composés organiques différents (Fig. S14), notamment des aromatiques, des aromatiques contenant de l'oxygène, des chloroaromatiques et des aromatiques soufrés. Des matières organiques spécifiques, telles que les alcanes à chaîne droite C12-C35 dans les échantillons UZ, U1 et U2, ont été détectées en faible abondance relative par rapport aux autres matières organiques (Fig. S14) et identifiées par leurs spectres de masse et leurs temps de rétention à l'aide d'un alcanes C10-C40. standard. Le fait que des alcanes aient été détectés à la limite de détection de l'instrument commercial utilisé indique qu'ils pourraient ne pas être détectables en utilisant le modèle de vol SAM, qui a une limite de détection environ dix fois inférieure par rapport à la version commerciale utilisée ici (~ppbv) . Cependant, des expériences de chimie humide de dérivation de type SAM utilisant MTBSTFA-DMF (voir méthodes) ont identifié des molécules polaires et des acides n-carboxyliques C7-C20 dérivés dans tous les échantillons, dévoilant la proline comme le seul acide aminé détecté (uniquement dans les échantillons de conglomérat supérieur, Fig. .S15), compatible avec le métabolisme actif des bactéries dans cet échantillon particulier. La détection d'acides gras dicarboxyliques et insaturés, ainsi que la découverte d'acides gras C16 et C18 et de proline, suggèrent que ces composés organiques seraient détectés par l'instrument SAM sur Mars. Cependant, cela ne serait possible que si ces molécules sont abondantes, et soumises à des variables instrumentales qui pourraient jouer un rôle supplémentaire dans leur détection, telles que les contraintes de température de l'instrument (colonne, piège, lignes de transfert, etc.), le temps limite de l'analyse en vol, la capacité de désorption du ou des pièges, etc.

Lorsque des échantillons de pierre rouge ont été analysés par pyrolyse flash avec l'instrument de banc d'essai MOMA55 (l'analyseur de molécules organiques de Mars à bord du rover Rosalind Franklin ExoMars), aucune matière organique n'a été détectée (Fig. S16). Cependant, lorsque ces échantillons ont été dérivatisés avec MTBSTFA-DMF (dérivatisation directe et extraction avant dérivatisation), quelques pics ont été identifiés, mais uniquement dans les échantillons d'évaporites ; espèces d'acides carboxyliques aliphatiques dérivées par silylation de leur groupe labile -OH (Fig. S17). Ces résultats ont non seulement révélé que la plupart des échantillons de Red Stone contenaient des niveaux organiques inférieurs aux limites de détection du MOMA, mais également l'importance cruciale des échantillons de terrain analogiques tels que Red Stone pour valider la prochaine génération d'instruments de vol.

Des échantillons de Red Stone ont également été analysés avec SOLID-LDChip, le Signs of Life Detector56,57,58, un instrument TRL5 conçu pour rechercher des biosignatures moléculaires sur d'autres planètes en utilisant le LDChip (Life Detector Chip), un immunoessai en sandwich à fluorescence multiplex. Semblable à d'autres analyses de banc d'essai, les détections SOLID étaient juste au-dessus de la limite de détection dans les échantillons de pierre rouge (Fig. S18), mais trouvaient toujours des preuves de bactéries hétérotrophes et, fait intéressant, de cyanobactéries, compatibles avec d'autres biosignatures provenant des micro-organismes existants et reliques utilisant d'autres techniques . La détection par SOLID d'anciens vestiges de cyanobactéries est particulièrement intéressante, car elle confirme que le delta de la rivière Red Stone avait suffisamment d'eau pour soutenir la photosynthèse il y a des millions d'années, mais plus maintenant car l'Atacama s'est asséché avec le temps (similaire au cas de Mars).

Dans l'ensemble, Red Stone offre une collection unique de caractéristiques géologiques et microbiologiques, fournissant un site de modèle analogique exceptionnel pour étudier la formation et l'habitabilité actuelle et passée d'un ancien delta d'éventail alluvial qui s'est formé dans des conditions arides dans un cadre analogue à Mars59. Les analyses d'échantillons de pierre rouge à l'aide de bancs d'essai mobiles dévoilent la pertinence des expériences de dérivation par chimie humide pour la détection des matières organiques dans les spectromètres de masse, bien que cette technique n'ait pas toujours été en mesure d'identifier tous les types de matières organiques. De plus, l'approche d'immunodosage SOLID s'est avérée être une technique prometteuse pour détecter les preuves de la vie microbienne, plutôt que seulement ses éléments constitutifs, bien que les micro-organismes martiens présents à des concentrations inférieures à celles de Red Stone puissent toujours ne pas être détectables. La détection limitée ou la non-détection par des instruments de banc d'essai de rover d'un certain nombre de biosignatures des microbes uniques existants et éteints dans les échantillons de pierre rouge soulignent également l'importance cruciale d'une mission de retour d'échantillons sur Mars, afin que les échantillons puissent être étudiés en profondeur pour détecter des signes de vie dans les laboratoires. sur Terre60.

La principale reconnaissance sur le terrain et l'échantillonnage de l'affleurement de pierre rouge ont eu lieu en août 2019, bien que l'échantillonnage ultérieur du site ait également eu lieu en février, mai, août et octobre 2021. Après avoir étudié les environs, l'exposition la plus continue a été sélectionnée pour tirer parti de la meilleure section transversale de l'enregistrement stratigraphique. Nous avons pris des photos de référence et en gros plan avant et après la collecte de matériel, suffisamment pour échantillonner non affecté par les intempéries et la quantité nécessaire pour l'analyse géochimique. L'échantillonnage a été méthodiquement enregistré, y compris les observations sur le terrain et leur profondeur avec un ruban à mesurer aussi perpendiculaire que possible au plan de litière, et stocké dans des sacs à fermeture éclair et des tubes en verre avec des couvercles en aluminium pour des analyses de biosignatures avec un étiquetage approprié. Certaines formations fragiles (revêtements et stratification de sel) ont été stockées en plus dans des tubes Falcon, pour pouvoir observer et analyser correctement plus tard en laboratoire. Nous avons prélevé 17 échantillons représentatifs des différents horizons le long de la séquence stratigraphique (certains ont nécessité un échantillonnage ultérieur supplémentaire comme indiqué ci-dessus) qui a été représenté sous la forme d'un log plot graphique à l'aide de Strater v5 (Golden Software).

La diffraction des rayons X sur poudre d'échantillons en vrac a été réalisée à l'aide d'un Bruker D8 Eco Advance avec un rayonnement Cu Kα et un détecteur linéaire Lynxeye XE-T. Les échantillons ont été scannés entre 5° (2θ) et 60° (2θ) en utilisant un pas de 0,05° (2θ) et un temps de comptage de 1 s. L'identification de phase a été réalisée en comparant le diagramme de diffraction mesuré avec les diagrammes de la base de données PDF avec le logiciel DIFFRAC.EVA (Bruker AXS). Ensuite, la fraction argileuse a été obtenue par décantation selon la loi de Stokes. La détermination de l'argile a impliqué un traitement : séchage à l'air, solvatation avec de l'éthylène glycol et chauffage à 350 et 500 °C pendant 2 h. Ensuite, les échantillons ont été scannés avec une taille de pas de 0,02° (2θ) sur la plage de 2 à 30°(2θ) avec un temps de collecte de 1 s à chaque étape.

Les spécimens orientés des échantillons de roche ont été analysés par XRD (Ultima IV) attaché à un dispositif de contrôle de l'humidité à l'Institut national des sciences des matériaux, au Japon. Les mesures ont été faites avec un rayonnement CuKa monochromatique à 40 kV et 30 mA. Les échantillons orientés ont été séchés dans une étuve sous vide à 100 °C pendant 15 h avant les mesures. Les spécimens séchés ont été placés dans la chambre d'échantillon. Les modèles XRD des échantillons ont été mesurés sous une humidité relative de 1% à 60%.

Pour examiner graphiquement les tendances d'altération, nous avons inclus certains des diagrammes ternaires les plus largement utilisés qui permettent l'interprétation graphique des changements chimiques proportionnels. Les diagrammes ternaires A-CN-K, ACN et A-CNK-FM, tracés à l'aide de Grapher v13 (Golden Software).

La température et l'humidité relative ont été mesurées sur le terrain à l'aide de micro-enregistreurs de température/humidité iButton (Maxim Integrated, San Jose, Californie, États-Unis) comme précédemment18,23, et réglés pour prendre des données toutes les 15 minutes pendant 2 mois.

Les échantillons de pierre rouge ont été conservés à température ambiante puis dénombrés par comptage direct en laboratoire. Comme la visualisation cellulaire est moins efficace lorsque les minéraux masquent les cellules en adsorbant les colorants traditionnels, nous avons utilisé le SYBR Green I (Molecular Probes, Eugene, USA) au lieu du DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride). En bref, 2 g de chaque échantillon ont été mis en suspension dans 10 ml de pyrophosphate tétrasodique 0, 01 M et soniqués doucement dans un nettoyeur à ultrasons Branson (Danbury, États-Unis) pendant 30 minutes dans de l'eau glacée. Après 10 s de sédimentation, 2 mL du surnageant ont été prélevés et placés directement sur un filtre à membrane en polycarbonate noir Isopore (taille des pores 0,2 μm, Millipore, Massachusetts, USA). Les membranes ont ensuite été incubées avec 1,5 mL de SYBR Green I (50 μg/L) pendant 15 min dans l'obscurité. Les membranes ont ensuite été lavées avec 10 ml d'eau distillée et laissées dans l'obscurité pour le séchage à l'air. Une goutte d'huile d'immersion a été déposée sur une lame de verre, puis le filtre et une autre goutte d'huile a été déposée sur la surface du filtre et recouverte d'un couvercle en verre. Les bactéries ont été comptées immédiatement à l'aide du microscope à fluorescence Zeiss AxioImager M.2 (Carl Zeiss, Jena, Allemagne) et d'un objectif à immersion dans l'huile Plan-Apo 63x ⁄ 1,4 Zeiss. Le jeu de filtres pour eGFP (Zeiss Filter Set 38 ; Excitation ⁄ Emission : 450–490 ⁄ 500–550 nm) a été utilisé pour la visualisation des bactéries colorées au SBI. Les bactéries ont été comptées en sélectionnant des champs de vision aléatoires, avec 20 champs par filtre analysés. Cinq filtres ont été comptés par échantillon, pour un total de 10 filtres et 200 champs observés.

Les échantillons pour l'hybridation in situ de fluorescence par dépôt de reporter catalisé (CARD-FISH) ont été fixés avec du formaldéhyde à 4 % dans du PBS et stockés à 4 ° jusqu'à une analyse plus approfondie. Les micro-organismes ont été détachés des particules minérales par sonication et filtrés dans des membranes noires de 0,22 mm (Millipore, Allemagne) dans des conditions aseptiques comme décrit dans la réf. 61. Les expériences CARD-FISH, la contre-coloration et leurs contrôles respectifs d'autofluorescence et de liaison non spécifique ont été réalisés comme décrit précédemment en détail62. CARD-FISH ont été réalisés à l'aide des sondes mixtes EUB338 I-III63,64 et ARC91565. De plus, CARD-FISH avec NON33866 a été réalisé comme contrôle d'hybridation supplémentaire. Les échantillons ont été visualisés et imagés comme déjà rapporté61.

Les échantillons de pierre rouge ont été stockés à température ambiante et l'ADN en a été extrait en laboratoire à l'aide du kit DNeasy PowerSoil Pro (Quiagen, Düsseldorf, Allemagne) conformément aux instructions du fabricant et comme précédemment effectué18,23,41.

Les concentrations d'ADN ont été quantifiées par Picogreen. Ensuite, apport variable d'ADN et nombre de cycles variable ont été utilisés dans une première PCR avec Q5® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) en présence de :

Amorces 100 nM pour l'amplification 16 S (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACACCTACGGGNGCWGCAG-3' et 5'- TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGACTACHVGGGTATCTAATCC-3', ces amorces amplifient la région V3-V4 de 16 S), amorces 200 nM pour l'amplification 18 S (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACAGCCAG CAVCYGCGGTAAY- 3' et 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCGTCAATTHCTTYAART-3'), amorces de 200 nM pour l'amplification d'Archaea (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACACGGRAAACTGGGGATAAT-3' et 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTRTTACCGCGGCGGCTGBCA-3'), amorces de 200 nM dans le cas de l'ITS (5'-ACACTGACGA CATGGTTCTACATCCTCCCGCTTATTGATATGC- 3' et 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGTGAATCATCGAATCTTTGAA-3') et amorces de 200 nM pour les cyanobactéries (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACAGGGGAATYTTCCGCAATGGG-3' comme avant, et 5'-TACGGTAGCAGAGAACTTGGTCTGACTACTGGGGTATCTAATCCCATT-3' ou 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTC TGACTACAGGGGGTATCTAATCCCTTT-3' comme inverse). Après la première PCR, une deuxième PCR de 12 ou 14 cycles a été réalisée avec la Q5® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) en présence de 400 nM d'amorces (5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGACGACATGGTTCTACA-3' et 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-[code à barres de 10 nucléotides]-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT-3') de la bibliothèque de codes à barres Access Array pour séquenceurs Illumina (Fluidigm).

Les amplicons finalement obtenus ont été validés et quantifiés par Bioanalyzer et un pool équimoléculaire a été purifié par électrophorèse sur gel d'agarosa et titré par PCR quantitative en utilisant le "Kapa-SYBR FAST qPCR kit forLightCycler480" et un standard de référence pour la quantification. Le pool d'amplicons a été dénaturé avant d'être ensemencé sur une cellule à flux à une densité de 10 pM, où des grappes ont été formées et séquencées à l'aide d'un "MiSeq Reagent Kit v3", dans un séquençage de 2 × 300 paires sur un séquenceur MiSeq. Nous notons ici qu'aucune archée ou séquence eucaryote (à l'exception de quelques contaminants fongiques bien connus) n'a été trouvée, ainsi seules les données 16 S sont présentées dans le rapport principal. Toutes les données de séquence brutes ont été déposées au NCBI Sequence Read Archive (SRA, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) sous le numéro d'accession PRJNA908755.

Les séquences brutes ont été traitées dans le logiciel MOTHUR v.1.43.067, à l'aide d'un script personnalisé basé sur MiSeq SOP68, comme précédemment utilisé avant69,70,71,72,73. La richesse microbienne de l'OTU (S) et l'indice de diversité de Shannon (H') ont été calculés avec le langage R pour le calcul statistique (R Core Team, 2019), en utilisant le package "vegan" v.2.5-674. Pour une meilleure visualisation de la composition de la communauté bactérienne, une carte thermique a été construite au moyen du logiciel STAMP v.2.1.375.

Au laboratoire, les échantillons ont été conservés à température ambiante, puis inoculés de manière aseptique dans des boîtes de Pétri contenant de la gélose et du bouillon Luria-Bertani (Sigma-Aldrich, Missouri, États-Unis), du milieu marin ou du milieu de croissance Czapek Dox modifié (CondaLab, Torrejón de Ardoz, Espagne). Cela a été fait en saupoudrant directement un total de 100 mg par échantillon de sol dans les boîtes de Pétri contenant les milieux susmentionnés, en incubant ces plaques à 25 ° C. Dans la plupart des cas, des colonies provenant de particules de sol étaient évidentes 2 semaines après l'inoculation. Toutes les colonies ont ensuite été remises en culture dans le milieu à partir duquel elles ont été isolées pour la première fois, afin d'obtenir suffisamment de biomasse pour l'extraction et le stockage ultérieurs de l'ADN.

Les échantillons ont été conservés à température ambiante et l'ADN en a été extrait en laboratoire à l'aide du kit DNeasy UltraClean Microbial (Quiagen, Düsseldorf, Allemagne) conformément aux instructions du fabricant et comme précédemment effectué18,21,41.

Comme précédemment effectué18,21,41, les gènes d'ARNr 16S d'isolats bactériens ont été amplifiés en laboratoire à l'aide du GoTaq Green Master Mix (Promega, Wisconsin, USA) et des amorces 341 f (5′CCT ACG GGNGGC WGC AG3′) et 785r (5′GAC TAC HVGGG TAT CTA ATC C′). Les conditions de PCR utilisées étaient : 95 °C pendant 5 min et 25 cycles de (95 °C pendant 40 s, 55 °C pendant 2 min, 72 °C pendant 1 min) suivis de 72 °C pendant 7 min. L'ARNr 18S d'isolats fongiques a été amplifié en laboratoire à l'aide du GoTaq Green Master Mix (Promega, Wisconsin, USA) et des amorces F566 (5'CAG CAG CCG CGG TAA TTCC3') et R1200 (5'CCC GTG TTG AGT CAA ATT GAA C3'). Les conditions de PCR utilisées étaient : 95 °C pendant 15 min et 35 cycles de (95 °C pendant 45 s, 60 °C pendant 45 s, 72 °C pendant 1 min) suivis de 72 °C pendant 10 min. Les réactions résultantes ont été visualisées dans un gel d'agarose TAE à 2% à 50 V. Le séquençage automatisé des produits de PCR résultants a été réalisé par Macrogen DNA Sequencing Inc. (Séoul, Corée). La qualité des séquences a été vérifiée à l'aide du logiciel BioEdit (Ibis Therapeutics, Carlsbad, États-Unis) et coupée avant d'utiliser l'option Megablast pour les séquences très similaires de l'algorithme BLASTN par rapport à la base de données non redondante du National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm. nih.gov) pour rechercher l'espèce la plus proche de chacun des isolats obtenus.

L'analyse phylogénétique des séquences de gènes d'isolats d'ARNr 16 S et d'ARNr 18 S a été réalisée en alignant les séquences par comparaison de séquences multiples par attente logarithmique, analysées avec jModelTest puis par Phylip NJ (bootstrap 10 000), tous les outils du logiciel d'analyse phylogénétique Bosque disponible gratuitement. (version1.7.152)134. Toutes les séquences de gènes isolés ont été déposées dans la base de données de séquences génétiques du NIH (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) à la fois pour les séquences d'ARNr 16 S (OP955639 à OP955657) et d'ARNr 18 S (OP954719 et OP962462 ).

Des sous-échantillons de sols lyophilisés (10 à 20 g), ont été dopés avec des étalons internes de n-alcanes (tétracosane-D50) et d'acides n-alcanoïques (acide myristique-D27) puis extraits avec un mélange de dichlorométhane et de méthanol (DCM:/ MeOH, 3:1, v/v) par sonication aux ultrasons (3 cycles de 10 min). L'extrait lipidique total (TLE) a été concentré à environ 0, 5 ml à l'aide d'un évaporateur rotatif, puis digéré pendant une nuit à température ambiante dans un mélange de potassium méthanolique (6% p / p), séparé en fractions neutre et acide. La fraction lipidique neutre a été obtenue en extrayant trois fois le mélange méthanolique de potassium avec 30 ml de n-hexane (Hx), en l'évaporant par rotation et en le récupérant avec ~ 1 ml de Hx: DCM (9: 1, v / v). La fraction lipidique acide a été obtenue en ajoutant HCl au mélange de potassium méthanolique restant et en l'extrayant avec 30 ml de Hx (trois fois), puis elle a été concentrée à l'aide d'un évaporateur rotatif et recueillie avec du DCM. Une séparation supplémentaire de la fraction neutre en sous-fractions non polaires (hydrocarbures) et polaires a été effectuée en éluant la fraction neutre concentrée (~ 1 ml de Hx: DCM) sur une colonne d'alumine en utilisant ~ 0, 5 g de poudre d'Al2O3 dans un Pasteur précombusté. pipeter avec 4,5 ml de Hx:DCM (9:1, v/v) et 3 ml de DCM:méthanol (1:1, v/v), respectivement. Les fractions non polaires et acides ont été analysées par spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse (GC-MS), par injection directe sur Hx, le premier, ou par injection après dérivatisation avec BF3 dans MeOH pour former des esters méthyliques d'acides gras (FAME). L'analyse GC-MS a été réalisée à l'aide d'un système 6850 GC couplé à un 5975 VL MSD avec un détecteur triple axe (Agilent Technologies) fonctionnant avec une ionisation électronique à 70 eV et balayant de m/z 50 à 650. 1 µl d'analytes ont été injectés et séparés sur une colonne HP-5MS (30 mx 0,25 mm id x 0,25 µm d'épaisseur de film) avec He comme gaz porteur à un débit constant de 1,1 ml·m-1. Pour analyser la fraction non polaire, la température du four a été programmée pour augmenter progressivement de 50 °C à 130 °C à 20 °C·min−1 puis à 300 °C à 6 °C·min−1 (maintenu 20 min ). Pour l'analyse de la fraction acide, la température du four a été programmée de 70 °C à 130 °C à 20 °C.min-1 puis à 300 °C à 10 °C.min-1 (tenue 10 min). La température de l'injecteur a été fixée à 290 °C, la ligne de transfert à 300 °C et la source MS à 240 °C. L'identification des composés était basée sur la comparaison des spectres de masse avec des matériaux de référence, et leur quantification sur l'utilisation de courbes d'étalonnage externes des n-alcanes (C10 à C40) et des esters méthyliques d'acides gras (FAME ; C8 à C24). Tous les produits chimiques et standards ont été fournis par Sigma Aldrich (San Luis, Missouri, USA). La récupération des étalons internes a été en moyenne de 71 ± 14 %.

La composition isotopique stable du carbone organique (δ13C) a été mesurée sur les échantillons de sol en vrac à l'aide de la spectrométrie de masse à rapport isotopique (IRMS), selon la méthode USGS76. En bref, tous les échantillons ont été homogénéisés par broyage avec un mortier et un pilon. Ils ont ensuite été décarbonatés (sols) avec de l'HCl (3 N) et, après 24 h d'équilibrage, ils ont été ajustés à pH neutre avec de l'eau ultra pure. Les échantillons ont été séchés dans une étuve (50°C) jusqu'à poids constant. Les rapports de δ13C et δ15N ont été mesurés dans un IRMS MAT 253 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) et rapportés dans la notation standard pour mille (‰). Trois étalons certifiés ont été utilisés (USGS41, IAEA-600 et USGS40) avec une précision analytique de 0,1 ‰. La teneur en carbone organique total (TOC %) a été mesurée avec un analyseur élémentaire (HT Flash, Thermo Fisher Scientific, Waltham Massachusetts, USA) lors de la mesure des isotopes stables.

Des spectres Raman ont été réalisés en excitant l'échantillon avec un laser à solide Nd: YAG non polarisé d'une longueur d'onde de 532 nm. Après focalisation sur un monochromateur (Horiba Jobin Yvon HRi550), avec un réseau de diffraction de 1200 sillons/mm, la lumière diffusée a été détectée avec un dispositif à couplage de charge (CCD), 1024×256 pixels, refroidi à 203 K pour la réduction du bruit thermique . Le spectromètre est relié par fibre optique à un microscope B&W Tek avec un objectif 50x qui permet une taille de spot sur l'échantillon de 42 µm (Microbeam SA, Espagne). La résolution spectrale, avec une largeur de fente de 200 µm, donne des résultats meilleurs que 5 cm-1. Les spectres Raman ont été pris dans une gamme de puissance laser de 20 à 150 mW, 10 à 100 s de temps d'intégration et 3 accumulations.

La caractérisation infrarouge d'échantillons de pierre rouge a été réalisée à l'INAF-Observatoire d'Astrophysique d'Arcetri (Florence, Italie) à l'aide d'un interféromètre à double pendule à faisceau unique VERTEX 70 v (Bruker), équipé d'un accessoire de réflexion diffuse Praying MantisTM (Harrick DRIFT) afin de transporter analyse par spectroscopie à transformée de Fourier infrarouge à réflexion diffuse (DRIFTS). Plus précisément, nous avons acquis des spectres de réflectance dans la région spectrale 400-8000 cm−1, en utilisant une résolution de 4 cm−1, une source Globar, un séparateur de faisceau KBr, un détecteur DTGS, et dans la région spectrale 8000-20000 cm−1, utilisant une résolution de 8 cm−1, une source Tungstène, un séparateur de faisceau CaF2 et un détecteur InGaAs, afin de couvrir toute la gamme spectrale pertinente pour les instruments de vol spatial tels que SuperCam (gamme spectrale 1,3-2,6 μm + 0,4–0,85 μm) à bord de la mission de rover NASA Mars 2020, Ma_MISS (gamme spectrale 0,5-2,3 μm), ISEM (gamme spectrale 1,1-3,3 μm) et MicrOmega (gamme spectrale 0,95-3,65 μm + 0,5-0,9 μm) à bord du rover ESA-Roscosmos ExoMars 2022 mission.

Les échantillons de pierre rouge ont été broyés sur un mortier d'agate et tamisés à l'aide d'un ensemble de tamis de différentes tailles de pores, afin d'obtenir des tailles de particules égales ou inférieures à 250 μ FT Raman a été effectué à l'aide d'un instrument Bruker RFS 100 avec une source d'excitation de 1064 nm et une tache de 100 microns. Deux spectres de deux points différents ont été acquis en utilisant un total de 1024 scans par spectre. Analyses Micro Raman à 633 nm. Pour cela une source d'excitation de 633 nm, et un microscope NIKON comme optique de focalisation/collecte ont été utilisés, donnant des tailles de spot variables des analyses, en fonction de l'objectif, allant jusqu'à des spots de 25 microns. La spectroscopie haute performance a été réalisée avec un Holospec 1.8i et une tête Raman de Kaiser Optical Systems. Pour les analyses guidées par l'opérateur, quatre spectres différents ont été analysés pour les principaux composants, en mettant l'accent sur les grains individuels. Pour le simulateur RLS, l'acquisition automatique sur un total de cent spots de 50 microns a été acquise, avec un système automatisé décrit dans la réf. 77.

Cinq observations de 30 tirs laser chacune ont été faites sur les échantillons avec la réplique de laboratoire de l'instrument ChemCam. Les échantillons étaient situés à 1,6 mètre de l'instrument, contenus dans une chambre entourée de 7 Torr de CO2 pour imiter l'atmosphère de Mars. Les données LIBS ont été prétraitées à l'aide des méthodes décrites dans78 pour éliminer le fond et le continuum non laser et pour calibrer la longueur d'onde. Des observations TRLS (spectroscopie de luminescence résolue en temps) ont été faites avec une réplique de laboratoire de l'instrument SuperCam.

Des expériences de pyrolyse de type vol ont été réalisées à l'aide d'un pyrolyseur à plusieurs coups Frontier Laboratories 3030D de la société Quantum Analytics. Les échantillons ont été réduits en poudre et des aliquotes (~ 20 mg) ont été déposées dans la coupelle de pyrolyse en acier inoxydable. Les échantillons ont été chauffés de 40 à 850 °C à 35 °C/min, ce qui a reproduit la vitesse de la rampe de pyrolyse utilisée sur l'instrument Sample Analysis at Mars (SAM) à bord du rover Curiosity79. Des expériences de spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse (GC-MS) ont été menées sur un traceur 1310 GC couplé à un spectromètre de masse quadripolaire ISQ (tous deux de la société Thermo Fisher). Le GC était équipé d'une colonne capillaire Restek MXT-5 (30 m de long x 0,25 mm ID collée avec une phase stationnaire de 0,25 µm d'épaisseur) similaire à celle utilisée par le SAM et permettant d'analyser et de séparer une large gamme de molécules (~C5 -C30). La rampe GC a été initialement chauffée à 35 ° C et maintenue pendant 5 min, suivie d'une rampe de 5 ° C / min jusqu'à 300 ° C, maintenue pendant 2 min. Le gaz porteur était de l'hélium et réglé à 1,2 ml/min. Les échantillons ont été analysés en mode sans division et les températures de l'injecteur, de la ligne de transfert et de la source d'ions ont toutes été réglées à 300 °C. Le MS a été réglé pour balayer des gammes de masses entre m/z 40 et 535 amu. Pendant la durée de la pyrolyse, les volatils ont été piégés à l'entrée de la colonne par un piège froid en verre d'azote liquide situé à l'intérieur du four GC, juste après l'injecteur GC. Au moment où la pyrolyse s'est terminée, le piège froid s'est arrêté et chauffé, de sorte que l'analyse GC peut commencer. Des blancs ont été réalisés entre chaque analyse simple pour prévenir et contrôler les contaminations potentielles. Le MTBSTFA-DMF est l'un des deux réactifs de chimie humide présents sur l'instrument SAM54. La dérivatisation du MTBSTFA est une technique de silylation non sélective qui facilite l'extraction et la détection de molécules polaires (p. Les expériences de dérivation SAM ont été imitées en laboratoire en déposant ~ 20 mg d'échantillon solide dans la coupelle de pyrolyse, qui elle-même a été placée dans un flacon ouvert de 2 ml. Les échantillons ont été dopés avec 40 nmol de DL-Fluorovaline utilisé comme étalon interne pour contrôler l'efficacité de la dérivatisation après analyse. Les échantillons ont ensuite été séchés pendant ~ 48 h à 40 ° C pour limiter les interférences du réactif MTBSTFA avec l'eau adsorbée sur l'échantillon. Avant l'analyse par pyrolyse, 20 uL de MTBSTFA-DMF ont été déposés dans la coupelle d'échantillon et chauffés à 75 ° C pendant 15 min après que le flacon a été scellé. De plus, pour imiter la première étape de chauffage SAM, cette température a déjà été optimisée et s'est avérée être la plus efficace pour les molécules polaires standard dérivées. Après chauffage, la coupelle a été rapidement chargée dans le pyrolyseur pour minimiser l'évaporation du solvant MTBSTFA. L'échantillon a ensuite été chauffé de 75 °C à 850 °C dans des conditions de type SAM en utilisant la vitesse de chauffage SAM de 35 °C/min. La colonne chromatographique a été initialement chauffée à 40 °C (pas de maintien) suivie d'une première rampe de 10 °C/min jusqu'à une température de 80 °C, suivie d'une deuxième rampe de température à 5 °C/min jusqu'à une température finale. de 310 °C maintenue pendant 5 min pour étuver la colonne avant la prochaine analyse. Comme pour l'expérience de pyrolyse, le gaz vecteur utilisé était de l'hélium et réglé à un débit de 1,2 ml.min-1 avec un débit fractionné de 75 ml/min pour limiter la saturation des réactifs. La source d'ions MS et la ligne de transfert ont toutes deux été réglées à 300 ° C et les ions produits par la source d'ionisation électronique à 70 eV ont été balayés avec des rapports masse sur charge (m / z) compris entre 40 et 535 avec un temps de balayage de 0,2 s de 9 min (délai de solvant) à la fin du cycle.

Pyrolyse : Toutes les procédures instrumentales ont été réalisées à l'aide d'un pyrolyseur multi-coups Frontier Laboratories 3030D (FrontierLab) monté sur l'injecteur split/splitless d'un chromatographe en phase gazeuse Trace Ultra couplé à un spectromètre de masse quadripolaire ISQ (Thermo Fisher).

20 mg de chaque échantillon ont été pesés dans une coupelle en acier nettoyée organiquement (précision microscopique : 0,01 mg) et placés au sommet du pyrolyseur (froid). La coupelle a ensuite été descendue dans le four du pyrolyseur chauffé à 400 °C ou 600 °C et est restée 30 s à cette température. Le contenu gazeux de l'échantillon a été directement transféré sur une colonne MXT-5 de type MOMA (20 m de long; 0,25 mm de diamètre interne; 0,25 μm d'épaisseur de phase stationnaire) (Restek) pour la séparation chromatographique. L'injecteur a été réglé à 250 °C et le programme de température du GC a démarré à 40 °C suivi d'une rampe de 10 °C. min-1 pour atteindre une température finale de 300 °C, et reste 10 min à 300 °C. Comme pour le spectromètre de masse, la source d'ions et la température de la ligne de transfert ont été chauffées à 300 ° C, et le faisceau d'électrons de la source d'ions réglé à 70 eV pour balayer le rapport masse ionique sur charge (m / z) de 10 à 600.

Dérivatisation : Tous les échantillons ont été dérivatisés avec un réactif de silylation présent dans la suite instrumentale MOMA, le N,N-méthyl-tert-butyl-diméthylsilyltrifluoroacétamide (MTBSTFA). Du N,N-diméthylformamide (DMF) a été ajouté au MTBSTFA (1:4) comme solvant et pour favoriser la réaction de dérivatisation81. Deux méthodes de dérivatisation ont été menées : une méthode de dérivatisation directe et une extraction avant dérivatisation.

dérivation directe ; 50 mg de chaque échantillon ont été transférés dans un flacon en verre (précision microscopique : 0,01 mg). 100 μL de réactif de dérivatisation et 1 μL d'étalon interne (laurate de méthyle à 10-2 M dans l'acétate d'éthyle) ont été ajoutés. La solution est ensuite chauffée à 75°C pendant 15 min. 0,5 μL du surnageant ont été injectés manuellement dans l'instrument GCMS.

Méthode d'extraction ; Comme la matière organique présente dans les échantillons s'est avérée soit absente, soit en très faible abondance avec l'expérience de pyrolyse, nous avons procédé à une extraction avant dérivatisation afin de concentrer le contenu organique. 50 mg de l'échantillon ont été transférés dans un flacon en verre (précision microscopique : 0,01 mg). 250 μl d'une solution (1:1) d'eau et de méthanol ont été ajoutés à l'échantillon afin d'extraire les composés solubles dans l'eau tels que les acides aminés ainsi que d'autres composés organiques qui ont une solubilité plus élevée dans les solvants organiques tels que les acides gras. Les bouchons vissés ont en outre été scellés avec du parafilm pour éviter les fuites d'eau et les flacons ont été placés dans un bain à ultrasons (Branson 2200) pendant 2 h. La solution liquide a ensuite été transférée dans un tube Eppendorf et centrifugée pour séparer les phases. Le tube a été chauffé à 75°C sous un flux d'azote jusqu'à ce que la phase liquide se soit évaporée. 50 μL d'agent de dérivatisation et 1 μL d'étalon interne (comme précédemment) ont été ajoutés. L'échantillon a été chauffé à 75 ° C pendant 15 min et 0,5 μL du surnageant a été injecté manuellement avec une microseringue au GC. La présence potentielle de contaminants chimiques provenant des tubes Eppendorf par chauffage a été évaluée par contrôle GC-MS et aucune contamination n'a été détectée. Deux répliques ont été faites pour chaque échantillon pour les deux méthodes afin d'assurer la répétabilité de nos expériences. Toutes les procédures instrumentales ont été réalisées sur un chromatographe en phase gazeuse Trace 1300 couplé à un spectromètre de masse triple quadripôle TSQ 9000. Nous avons utilisé une colonne RTX-5 standard (30 m de long ; 0,25 mm de diamètre interne ; 0,25 μm d'épaisseur de phase stationnaire) de Restek. Le programme de température et les paramètres du spectromètre de masse étaient les mêmes que pour les expériences de pyrolyse.

Un immunocapteur basé sur un microréseau de 200 anticorps (LDChip ou Life Detector Chip), le cœur de l'instrument SOLID (Signs of Life Detector) développé pour l'exploration planétaire, cible une grande variété et des tailles moléculaires de biomarqueurs microbiens, principalement des polymères82,83,84 . La fraction IgG des anticorps polyclonaux a été imprimée dans un microréseau à motif de points en triple sur des lames de verre de microscope afin que 9 LDChip complets puissent être définis par lame comme décrit précédemment85. La liste complète des anticorps sur LDChip se trouve dans la réf. 86. Les échantillons de sol solide ont été traités selon une procédure similaire à celle automatique parfumée par l'instrument SOLID. En bref, 0,5 g ont été remis en suspension dans 2 ml de solution saline tamponnée au tris de lyse / incubation avec un tampon double renforcé Twin20 (TBSTRR) (0,4 MTris-ClH, pH 8, 0,3 M NaCl, 0,1% Tween 20), ultrasonique pendant 3 × 1 min impulsions et filtré à travers 20 microns pour éliminer les particules grossières86. Ensuite, 50 uL de chaque extrait brut ont été incubés pendant 8 h à 4 ° C avec LDChip dans chaque chambre correspondante du module d'analyse multiarray (MAAM) 71 qui simule l'unité d'analyse d'échantillon SOLID (SPU). Le contrôle vide ne contenait que le tampon. Après lavage avec du tampon TBSTRR, toutes les chambres ont été incubées avec 50 µL d'un mélange d'anticorps marqués par fluorescence (0,5-1 µg/mL chacun) pendant 12 h à 4 °C comme traceurs pour les immunoréactions. Après lavage et séchage, les puces ont été scannées pour la fluorescence, l'image traitée, quantifiée et analysée comme décrit ailleurs85,86.

Disponibilité des données et des matériaux : toutes les données et tous les échantillons sont disponibles gratuitement sur demande auprès d'AAB. Toutes les données de séquence brutes NGS ont été déposées au NCBI Sequence Read Archive (SRA, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) sous le numéro d'accession PRJNA908755. Toutes les séquences de gènes isolés ont été déposées dans la base de données de séquences génétiques du NIH (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) à la fois pour les séquences d'ARNr 16 S (OP955639 à OP955657) et d'ARNr 18 S (OP954719 et OP962462 ). Les données sources sont fournies avec ce document.

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La recherche menant à ces résultats est une contribution du projet "MarsFirstWater", financé par le Conseil européen de la recherche, Consolidator Grant no 818602 à AGF, et par le Human Frontiers Science Program grant n° RGY0066/2018 à AA-B. Un financement supplémentaire a été fourni par la subvention MINECO PID2019-107442RB-C32 (OP-B. et AM), Subventions d'aide à la recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science numéros de subvention 17H06458 et 21H04515 (KF), numéros de subvention 17H06456 , 17H06458, 20H00195 et 21H04515 (KF et YS), Consejería de Educación e Investigación, Comunidad Autónoma de Madrid/Programme du Fonds social européen (MAFM), subvention n° ESP2017-87690-C3-3-R (DC), Ramón y Subvention Cajal n° RYC2018-023943-I (LS-G.), Subvention AEI MDM-2017-0737 et Subvention MCIN/AEI PID2019-107442RB-C32 (VM-I.), MCIU/AEI (Espagne) et FEDER (UE ) subvention n° PGC2018-094076-B-I00 (JW et CA), accord de l'Agence spatiale italienne 2017-48-H.0 (TF, JRB et GP), subvention du ministère des Sciences d'Espagne PID2019-107442RB-C31 (JAM , MV, GLR, AA et FR), programme de bourses d'excellence de María Zambrano (CA3/RSUE/2021-00405), financé par le ministère espagnol des universités (MFM), contrats du programme d'exploration de Mars de la NASA NNH13ZDA018O, NNH15AZ24I, NNH13ZDA018O et laboratoire LANL Recherche et développement dirigés (LDRD) finançant XX5V (AMO, RCW, AR et SMC), subvention NASA-GSFC NNX17AJ68G (MM et SSJ), NES s'est concentré sur l'analyse d'échantillons à Mars de la mission Mars Science Laboratory et analyseur de molécules organiques de Mars de la mission Exomars 2022 (OM, CS et CF), et accorde RTI2018-094368-B-I00 et MDM-2017-0737 Unidad de Excelencia "Maria de Maeztu"- Centro de Astrobiología (INTA-CSIC) par le ministère espagnol de Science et innovation/Agence nationale de la recherche MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 et par « FEDER Une façon de faire l'Europe » (CE, MGV, MM-P., et VP). RCW remercie Dot Delapp pour avoir effectué le pré-traitement des données LIBS. Les auteurs remercient également USGS Earth Explorer pour avoir fourni les données satellitaires de Sentinel 2020.

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Armando Azua-Bustos, Alberto G. Fairén, Olga Prieto-Ballesteros, Daniel Carrizo, Laura Sánchez-García, Victor Parro, Cristina Escudero, Victoria Muñoz-Iglesias, Maite Fernández-Sampedro, Antonio Molina, Miriam García Villadangos et Mercedes Moreno-Paz

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Armando Azua-Bustos

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Maëva Millan

LATMOS/IPSL, UVSQ Université Paris-Saclay, Sorbonne Université, CNRS, 11 Bd d’Alembert, 78280, Guyancourt, France

Maëva Millan

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Institut de technologie de la nature et de l'environnement, Université de Kanazawa, Kanazawa, Japon

Yasuhito Sekine et Keisuke Fukushi

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Elisabeth Rampe

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Correspondance à Armando Azua-Bustos.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Hamidah Idris, Carol Stoker et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Azua-Bustos, A., Fairén, AG, González-Silva, C. et al. Le microbiome sombre et les matières organiques extrêmement faibles dans le delta fossile d'Atacama dévoilent les limites de détection de la vie sur Mars. Nat Commun 14, 808 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36172-1

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Reçu : 28 juin 2022

Accepté : 17 janvier 2023

Publié: 21 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-36172-1

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Communication Nature (2023)

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